La Pinacoteca nasce con l’intento di salvaguardare il patrimonio artistico locale minato dalle dispersioni che seguirono le soppressioni di età napoleonica e dal bisogno di evidenziare una riconoscibile identità locale. Risale al 1836, quando furono riuniti in Comune 46 dipinti, di medio e grande formato, soprattutto cinquecenteschi prelevati dalle chiese cittadine e lì, il più delle volte, sostituite da copie. Nel 1866 la raccolta venne trasferita a Palazzo dei Diamanti. Negli anni la collezione della Pinacoteca si arricchì grazie all'acquisizione di opere da raccolte private ferraresi, fra tutte la copiosa quadreria Costabili, mentre le iniziative espositive, come la mostra della pittura ferrarese organizzata nel 1933 da Nino Barbantini, costituirono per il pubblico una rivelazione e uno stimolo alla riconsiderazione critica e conservativa delle raccolte. Altresì, negli stessi anni, le pubblicazioni di Roberto Longhi contribuirono fortemente a questo scopo grazie alla rivalutazione e rilettura di due secoli di storia dell'arte locale.Negli ultimi quaranta anni la collezione ha subito un costante e notevole incremento tramite l'acquisizione di opere dalle collezioni Magrini e Valli, nel 1973 con la donazione Vendeghini Baldi, mentre dal 1970 si effettuarono importanti recuperi sul mercato antiquariale, voluti da Cesare Gnudi e da Eugenio Riccomini.
Dagli anni Ottanta, grazie ad una politica culturale tenacemente perseguita dal Soprintendente Andrea Emiliani, da Jadranka Bentini e da Grazia Agostini, si intensificò l’integrazione delle vaste lacune quattrocentesche che caratterizzavano in negativo la raccolta storica, così da definire sempre meglio il ruolo del museo nella città.
In questo senso va il deposito del 1984 della collezione della Cassa di Risparmio di Ferrara, soprattutto costituita dalla raccolta Massari
Nel 1992 l’acquisizione, tenacemente perseguita da Andrea Emiliani, da parte dello Stato di una importante porzione dei dipinti della Collezione Sacrati Strozzi, ceduti in pagamento di tasse di successione, portò, tra l’altro, all’insperato ritorno di due delle Muse dello Studiolo di Belfiore. Seguì il secondo lotto della medesima collezione, acquistato in asta dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Ferrara. Di tutto ciò, e dell’avvio di una ricognizione sulle vicende storiche del patrimonio artistico ferrarese, ha dato conto una grande mostra del 1996: "La leggenda del collezionismo. Le quadrerie storiche ferraresi" allestita in Pinacoteca.